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　　活體熒光成像不僅是臨床前研究中的一項(xiàng)常用影像技術(shù)，而且在近年來也逐漸被應(yīng)用在臨床手術(shù)中。經(jīng)靜脈或淋巴系統(tǒng)性遞送的特異性熒光探針可以在熒光成像模式下點(diǎn)亮疾病發(fā)生的部位，而無需事先了解病灶的位置。例如，利用吲哚菁綠作為熒光探針的一種手術(shù)導(dǎo)航方式已經(jīng)在肝癌轉(zhuǎn)移灶的切除和乳腺癌前哨淋巴結(jié)的清掃等方面提供了實(shí)質(zhì)性的臨床益處。然而，這些熒光探針的熒光是不可控的，常常因非特異性結(jié)合作用增加熒光背景，導(dǎo)致靈敏度不足。與之相比，可激活的熒光探針對(duì)疾病進(jìn)展中的生物標(biāo)志物，如蛋白酶、活性氧物種、弱酸性、低氧等有特異性反應(yīng)之后才發(fā)光，可以減少因脫靶造成的背景信號(hào)，從而進(jìn)一步提高成像對(duì)比度。然而在實(shí)際情況中，由于體內(nèi)復(fù)雜和異質(zhì)的生理環(huán)境，可激活的這一初衷通常在診斷多種疾病的能力方面受到損害和限制。尤其是，大多數(shù)探針傾向于與血液中無處不在的生物大分子（如血清白蛋白、脂蛋白）非特異性結(jié)合，這可能會(huì)觸發(fā)不需要的血液熒光背景并使探針的藥代動(dòng)力學(xué)復(fù)雜化，導(dǎo)致在病灶部位中的保留時(shí)間較短。更重要的是，目前可用的可激活探針主要發(fā)射可見光（VIS；400-700 nm）和近紅外（NIR-I；700-900 nm）信號(hào)，這些信號(hào)可能會(huì)因組織異質(zhì)性和深度位置而顯著衰減，進(jìn)一步降低了成像的對(duì)比度。

　　研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種細(xì)胞內(nèi)吞激活的近紅外二區(qū)熒光探針，在活體小鼠的腫瘤和踝關(guān)節(jié)損傷炎癥的診斷方面獲得了高對(duì)比度的成像效果，有望為多種疾病的臨床前研究、臨床診斷和手術(shù)導(dǎo)航提供新的解決方案。

二區(qū)細(xì)胞內(nèi)吞激活熒光探針的作用機(jī)制示意圖

　　溶酶體是細(xì)胞內(nèi)吞過程末端的酸性細(xì)胞器（酸性pH在5-6左右），其中的物質(zhì)被脂質(zhì)膜包圍，其間高密度分布的酸性水解酶和分解代謝物（如游離脂肪酸和脂質(zhì)）產(chǎn)生強(qiáng)烈的非共價(jià)相互作用環(huán)境。那么是否可以設(shè)計(jì)一種熒光探針只針對(duì)溶酶體這一特殊細(xì)胞內(nèi)環(huán)境而開啟，從而有效的避免血液背景熒光的干擾，提高病灶部位的成像對(duì)比度呢？

　　近年來的研究表明，由于組織散射和自發(fā)熒光的降低，在波長(zhǎng)為1000-1700納米的近紅外二區(qū)窗口成像可以顯著提高成像清晰度和信噪比。研究團(tuán)隊(duì)首先從苯并噻喃菁和苯并吡喃菁兩種近紅外二區(qū)熒光染料母體出發(fā)，通過區(qū)域選擇性地引入具有溶酶體定位和酸性響應(yīng)功能的哌嗪基團(tuán)，分別構(gòu)建了4個(gè)波長(zhǎng)不同的近紅外熒光探針。近紅外二區(qū)細(xì)胞成像結(jié)果表明，4個(gè)探針均具有良好的溶酶體定位與染色能力。其中最大發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)到近紅外二區(qū)且在溶酶體酸性條件下具有較大熒光響應(yīng)幅度的Lyso1005探針被選為模型探針進(jìn)行了后續(xù)的改良設(shè)計(jì)。

圖 1溶酶體激活與定位的近紅外二區(qū)熒光探針的構(gòu)建

　　研究人員合成了具有炔基官能團(tuán)的Lyso1005探針，并通過點(diǎn)擊化學(xué)方法進(jìn)一步修飾了親水性的聚乙二醇寡聚物。得到的探針被命名為CEAF（CellEndocytosis-Activated Fluorescent）探針，具有兩親性結(jié)構(gòu)，在水溶液中因聚集而發(fā)生顯著的熒光淬滅，而當(dāng)加入微量的表面活性劑Triton X100即可使探針重新恢復(fù)熒光，并且在溶液酸性達(dá)到pH = 5的情況下進(jìn)一步產(chǎn)生熒光增強(qiáng)效應(yīng)。整個(gè)過程總的熒光增強(qiáng)倍數(shù)達(dá)到了72倍，比未修飾的Lyso1005探針提高了17倍。此外，體外成像表明，探針在血漿、組織模擬液、細(xì)胞培養(yǎng)液等環(huán)境下均不能產(chǎn)生熒光，但細(xì)胞成像結(jié)果表明，CEAF探針可以選擇性的在溶酶體中被點(diǎn)亮。這一特性促使研究人員認(rèn)為，探針的臨界聚集濃度受溶液中非共價(jià)相互作用和酸性pH的共同調(diào)控，其后被進(jìn)一步利用實(shí)驗(yàn)證實(shí)發(fā)現(xiàn)：酸性環(huán)境可以有效地提高探針的臨界聚集濃度，促使探針更容易在外界非共價(jià)相互作用下發(fā)生解聚。

圖 2 兩親性細(xì)胞內(nèi)吞激活熒光探針的構(gòu)建及其細(xì)胞內(nèi)選擇性激活機(jī)制的研究

　　基于CEAF探針的溶酶體選擇性激活特性，團(tuán)隊(duì)測(cè)試了其在腫瘤成像與手術(shù)導(dǎo)航中的應(yīng)用。通過尾靜脈注射CEAF探針，小鼠CT26腫瘤可以被持續(xù)點(diǎn)亮超過36小時(shí)，并且點(diǎn)亮期間的腫瘤/背景信號(hào)比值持續(xù)超過Rose判據(jù)（信噪比大于或等于5是判斷某一信號(hào)是否為真實(shí)信號(hào)的判據(jù)）。活體顯微成像進(jìn)一步證實(shí)，CEAF探針的熒光只出現(xiàn)在血管外的腫瘤區(qū)域。這一特性在腫瘤手術(shù)切除過程中顯得尤為重要，特別是在使用常亮探針作為對(duì)照組的手術(shù)導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)中，切除腫瘤產(chǎn)生的血液外滲使得手術(shù)區(qū)域出現(xiàn)了大面積的熒光污染，影響了后續(xù)腫瘤位置的鑒別。

圖3 紅外二區(qū)細(xì)胞內(nèi)吞激活熒光探針在腫瘤成像與手術(shù)導(dǎo)航中的應(yīng)用

　　為凸顯這一策略的通用性價(jià)值，研究團(tuán)隊(duì)又在CEAF探針的基礎(chǔ)上進(jìn)一步的修飾了RGD靶向基團(tuán)，其可以與炎性M1型巨噬細(xì)胞上高表達(dá)的αvβ3受體特異性結(jié)合。通過構(gòu)建小鼠踝關(guān)節(jié)損傷模型，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CEAF-RGD探針不僅能夠持續(xù)點(diǎn)亮關(guān)節(jié)損傷部位，而且可以對(duì)脾臟部位進(jìn)行特異性的熒光成像。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，損傷發(fā)生后，脾臟和關(guān)節(jié)損傷部位的M1型巨噬細(xì)胞均大量增多。上述結(jié)果表明了CEAF探針在細(xì)胞特異性成像方面的巨大潛力。

圖4 紅外二區(qū)細(xì)胞內(nèi)吞激活熒光探針在細(xì)胞特異性的關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用

　　參考文獻(xiàn)：

　　Yue He+, Shangfeng Wang+*, Peng Yu+, Kui Yan, Jiang Ming, Chenzhi Yao, Zuyang He, Ahmed Mohamed El-Toni, Aslam Khan, Xinyan Zhu, Caixia Sun, Zuhai Lei and Fan Zhang*. NIR-II Cell Endocytosis-Activated Fluorescent Probes For In Vivo High-Contrast Bioimaging Diagnostics. Chem. Sci., 2021, 12, 10474–10482.