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　　近紅外二區(qū)熒光多重成像技術(shù)可以同時對活體深層組織內(nèi)的兩個或者多個生物過程進(jìn)行定性和定量的研究，因此，對于科研人員更好的理解疾病的發(fā)生機(jī)制、進(jìn)行藥物的篩選以及臨床上的精確診斷具有重要的意義。然而，由于缺乏在水溶液中具有完整吸收光譜以及良好光譜分離的高亮度近紅外二區(qū)染料，活體深層組織下的近紅外二區(qū)熒光多重成像具有很大的挑戰(zhàn)性。

　　團(tuán)隊構(gòu)建了一系列長波長的七甲川菁染料，并通過反離子配對策略有效增強(qiáng)了染料在水溶液中的光物理學(xué)性質(zhì)。最后，通過結(jié)合反離子配對的染料和激發(fā)波長相匹配的激光器構(gòu)建了近紅外二區(qū)激發(fā)雙色成像系統(tǒng)，并將該系統(tǒng)成功地用于同時成像小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)和代謝器官、腫瘤和腫瘤附近的血管系統(tǒng)、小鼠后肢的淋巴系統(tǒng)和血管系統(tǒng)。這是首次在活體深層組織內(nèi)實現(xiàn)近紅外二區(qū)激發(fā)和近紅外二區(qū)發(fā)射的熒光多重成像。

　　圖1：團(tuán)隊基于七甲川菁染料為母體設(shè)計了九種菁染料分子（命名為HC）。HCs染料是以吡喃或噻喃雜環(huán)為端基，中間以甲川共軛鏈相連，可以增加分子內(nèi)的推拉電子效應(yīng)，促使染料的波長紅移。同時，當(dāng)染料的雜原子由氧變成硫時，硫原子對核外電子的束縛能力減弱，導(dǎo)致染料的離域能力增強(qiáng)，迫使染料的波長紅移。而且，端基五元橋環(huán)結(jié)構(gòu)的引入不僅可以增加染料的光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，抑制染料的旋轉(zhuǎn)，提高量子產(chǎn)率，而且還可以提供超共軛效應(yīng)進(jìn)一步迫使染料的波長紅移。最后，通過在端基苯環(huán)上的不同位點修飾給電子的甲氧基，對染料的波長進(jìn)行更細(xì)微的調(diào)節(jié)。通過對染料光物理學(xué)性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)其最大吸收/發(fā)射波長都位于近紅外二區(qū)（1000-1700 nm），λmax，abs在1180-1312 nm的波長范圍內(nèi)可調(diào)，λmax，em在1222-1376 nm的波長范圍內(nèi)可調(diào)。

圖1.（a-d）HCs染料的設(shè)計思路和分子結(jié)構(gòu)；

（e）HCs染料的合成路線；

（f）部分HCs染料在DCE中的歸一化吸收光譜；

（g）部分HCs染料在DCE中的歸一化發(fā)射光譜。

　　圖2：首先，為了闡明雜原子和甲氧基取代對HCs染料的電子和幾何性質(zhì)的影響，團(tuán)隊對染料進(jìn)行了密度泛函理論（DFT）和含時密度泛函理論（TDDFT）計算。結(jié)果表明所有HCs染料的（S0→S1）能級與λmax，abs的變化趨勢密切相關(guān)，而且染料都具有平面的多甲川骨架，但末端的雜環(huán)是非平面的。

圖2.（a）計算出HCs染料的最高占據(jù)分子軌道（HOMOs）、最低未占據(jù)分子軌道（LUMOs）和S0–S1激發(fā)能（ΔE）；

（b）HCs染料的優(yōu)化基態(tài)（S0）幾何結(jié)構(gòu)。

　　圖3：隨后，團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，和已經(jīng)報道的近紅外二區(qū)菁染料類似，HCs膠束在水溶液中表現(xiàn)出吸收光譜的衰減和變寬，以及熒光猝滅，這通常可以由ACQ效應(yīng)和不對稱偶極結(jié)構(gòu)的形成來解釋。為了解決這個問題，團(tuán)隊引入反離子配對策略，使用體積龐大的疏水反離子作為空間間隔物來阻止染料的聚集，也可以作為軟離子來削弱極化。結(jié)果表明，反離子配對的染料在水溶液中表現(xiàn)出優(yōu)秀的光物理性質(zhì)，證明了其在生物成像方面具有潛在的應(yīng)用價值。

圖3.（a）HCs膠束和HC/F5-TPBs膠束的光物理性質(zhì)示意圖；

（b，c）HC1222和HC1342在DCE中的吸收光譜，以及負(fù)載1 wt% HCs、HC/TPBs和HC/F5-TPBs的膠束在水中的吸收光譜;

（d）吸收光譜的峰肩比；

（e）反離子（F5-TPB）交換前后染料膠束的亮度比較；

（f）HC1222/F5-TPB和HC1342/F5-TPB膠束歸一化的熒光強(qiáng)度與染料負(fù)載量的關(guān)系；

（g）ICG（水中）、ICG-FBS復(fù)合物、IR1061膠束、HC1222/F5-TPB膠束和HC1342/F5-TPB膠束在808 nm激光照射（600 mW/cm2）下的歸一化熒光強(qiáng)度。

　　圖4：進(jìn)一步，團(tuán)隊為了評估反離子配對的HCs染料的近紅外二區(qū)激發(fā)成像性能，分別研究了模擬生物組織和真實生物組織中的光學(xué)穿透性能以及活體成像性能。結(jié)果表明反離子配對的染料膠束擁有更高的亮度。此外，小鼠的全身血管成像結(jié)果證明了反離子配對策略提高染料成像性能的有效性，為近紅外二區(qū)激發(fā)的多重生物成像做好了準(zhǔn)備。

圖4.（a）HC1342/F5-TPB膠束在脂肪乳劑中的穿透實驗示意圖；

（b，c）HC1342/F5-TPB膠束覆蓋2 mm小鼠肌肉組織后的成像示意圖；

（d-k）小鼠大腦、背部、后肢和腹部血管成像示意圖。

　　圖5：最后，團(tuán)隊通過結(jié)合反離子配對的染料和激發(fā)波長相匹配的激光器構(gòu)建了近紅外二區(qū)激發(fā)雙色成像系統(tǒng)，并將該系統(tǒng)成功地用于同時成像小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)和代謝器官、腫瘤和腫瘤附近的血管系統(tǒng)、小鼠后肢的淋巴系統(tǒng)和血管系統(tǒng)。

圖5.（a）HC1222/F5-TPB和HC1342/F5-TPB的歸一化發(fā)射光譜以及1200-1300 nm通道（紅色）和1450-1700 nm（青色）通道的偽彩色圖像；

（b）代謝系統(tǒng)雙色成像的示意圖；

（c）腫瘤小鼠的雙色成像示意圖；

（d）沿c中黃色虛線的橫截面熒光強(qiáng)度分布；

（e）淋巴管和后肢血管的雙色成像示意圖；

（f）沿e中黃色虛線的橫截面熒光強(qiáng)度分布。

　　團(tuán)隊共設(shè)計合成了九個具有近紅外二區(qū)發(fā)射的七甲川菁染料，并通過反離子配對策略增強(qiáng)了染料在水溶液中的光物理學(xué)性質(zhì)。通過結(jié)合反離子配對的染料和激光器構(gòu)建了近紅外二區(qū)激發(fā)雙色成像系統(tǒng)，并將該系統(tǒng)成功地用于同時成像小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)和代謝器官、腫瘤和腫瘤附近的血管系統(tǒng)、小鼠后肢的淋巴系統(tǒng)和血管系統(tǒng)，首次在活體深層組織內(nèi)實現(xiàn)近紅外二區(qū)激發(fā)和近紅外二區(qū)發(fā)射的熒光多重成像。該研究拓展了熒光多重成像的能力，為活體深層組織內(nèi)的生物醫(yī)學(xué)成像提供了新的機(jī)會。

　　參考文獻(xiàn):

　　Yang Yang#, Caixia Sun#, Shangfeng Wang*, Kui Yan, Mengyao Zhao, Bin Wu and Fan Zhang*. Counterion-paired Bright Heptamethine Fluorophores with NIR-II Excitation and Emission Enable Multiplexed Biomedical Imaging. Angew. Chem. Int.Ed. , 2022, 61, e202117436.